jueves, 5 de marzo de 2009

LABORATORIO QUIMICO-BIOLOGICO Y CLINICO

BACTERIOLOGIA


Bacterias

Las bacterias poseen una estructura relativamente simple. Son microorganismos procariotas, es decir, unos microorganismos unicelulares sencillos, sin membrana nuclear, mitocondrias, aparato de Golgi ni retículo endoplásmico que se reproducen por división asexual. La pared celular que rodea a las bacterias es compleja, y existen dos formas básicas: una pared celular grampositiva con una gruesa capa de peptidoglucano y una pared celular gramnegativa con una delgada capa de peptidoglucano, así como una membrana externa. Algunas bacterias carecen de pared celular y compensan su ausencia sobreviviendo tan sólo en el interior de células del organismo anfitrión o en un ambiente hipertónico.



Para realizar una clasificación preliminar de las bacterias se utiliza su tamaño (de 1 a 20 Jim o más), forma (esferas, bastoncillos, espirales) y disposición espacial (células aisladas, en cadenas y formando cúmulos); mientras que su clasificación definitiva se refiere a sus propiedades fenotípicas y genotípicas. El organismo humano está habitado por miles de especies bacterianas distintas; mientras algunas mantienen una relación parasitaria temporal, otras habitan en el ser humano de manera permanente. También se encuentran bacterias en el ambiente, como el aire que se respira, el agua que se bebe y los alimentos que se comen; aunque muchas de ellas son relativamente avirulentas, otras son capaces de provocar enfermedades potencialmente mortales. La enfermedad puede deberse a los efectos tóxicos de los productos bacterianos (toxinas) o bien a la invasión de regiones corporales que acostumbran a ser estériles.





Clasificacion de las Bacterias

Clasificacion Fenotipica
Las morfologías microscópica y macroscópica de las bacterias fueron las primeras características utilizadas para identificarlas y aún constituyen unos elementos fundamentales en la mayoría de los algoritmos de identificación utilizados actualmente. Además, el aspecto macroscópico de las colonias bacterianas (p. ej., las propiedades hemolíticas en un medio de agar sangre, la pigmentación, el tamaño y la forma de las colonias y el olor de las colonias) también se emplea en la identificación
de las bacterias. Las características morfológicas se utilizan para realizar una identificación provisional del microorganismo y poder seleccionar otros métodos de clasificación con un mayor poder de discriminación, ya que muchos microorganismos pueden presentar un aspecto muy similar en el examen macro y microscópico. Los métodos más frecuentes y que todavía se utilizan en la identificación de las bacterias consisten en determinar la presencia o la ausencia de unos marcadores bioquímicos específicos (p. ej., capacidad de fermentación de hidratos de carbono específicos o la utilización de diferentes compuestos como fuente de carbono para poder proliferar; presencia de proteasas, lipasas o nucleasas específicas; o presencia de enzimas hidrolíticas específicas como lipasas y nucleasas). El empleo de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar con un alto grado de precisión la mayoría de las cepas clínicamente significativas. Además, estos métodos se han empleado para subdividir los grupos de microorganismos más allá del nivel de especie, principalmente con fines epidemiológicos (p. ej., para determinar si un grupo de microorganismos pertenecientes al mismo género y especie comparten un origen común o bien proceden de fuentes distintas). Estas técnicas son conocidas como determinación del biotipo o biotipado. ísticos, los anticuerpos utilizados para su detección constituyen
una potente herramienta diagnóstica (serotipado). Estas pruebas serológicas se realizan con el fin de identificar microorganismos que son inertes frente a las pruebas bioquímicas (p. ej., Francisella, el microorganismo causante de la tularemia), cuyo cultivo es difícil o imposible (p. ej., Treponema pallidum, el microorganismo responsable de la sífilis), asociados a síndromes específicos o deben identificarse de forma rápida (p. ej., S. pyogenes, responsable de la faringitis estreptocócica). Por otra parte, la determinación de los serotipos se emplea también con fines epidemiológicos. Otros ejemplos de los métodos fenotípicos utilizados en la clasificación de las bacterias son el estudio de los patrones de sensibilidad del microorganismo frente a distintos antibióticos (antibiograma) y el lisotipado (susceptibilidad a determinados virus que infectan a las bacterias). Las técnicas de susceptibilidad a los antibióticos tienen un menor poder de discriminación. El lisotipado es una técnica engorrosa, por lo que actualmente ha sido sustituida por técnicas genéticas con mayor sensibilidad.

Clasificacion Analitica
Las características analíticas de las bacterias se han utilizado también para clasificarlas en géneros, especies y subespecies. El patrón cromatográfico de los ácidos micólicos de la pared celular es característico de un gran número de especies de micobacterias, por lo que durante muchos años se ha utilizado en la identificación de las especies aisladas con mayor frecuencia. El análisis de los lípidos presentes en la totalidad de la célula también es un método útil para la descripción de numerosas especies bacterianas y de levaduras. Otras técnicas empleadas para la caracterización, fundamentalmente a nivel de subespecie y con fines epidemiológicos, son el análisis de las proteínas celulares (análisis proteómico mediante espectroscopia de masas) y las enzimas celulares (electroforesis enzimática tipo multiloci). Sin embargo, y pese a que estos métodos analíticos son precisos y reproducibles, requieren un gran trabajo y una instrumentación muy cara. Por tal motivo, estos análisis se emplean principalmente en los laboratorios de referencia.

Clasificacion Genotipica
El método más preciso de clasificación de las bacterias es el análisis de su material genético. Aunque inicialmente los microorganismos se clasificaron según la relación
guanina/citosina, este procedimiento se ha abandonado en gran medida a favor de otros métodos con mayor poder de discriminación. Aunque la hibridación del ADN (ácido desoxirribonucleico) se utilizó en un principio para establecer la relación existente entre las cepas bacterianas (es decir, para determinar si dos cepas pertenecían al mismo género o especie), más recientemente esta técnica se ha empleado para conseguir una rápida identificación de los microorganismos
mediante el uso de sondas moleculares. Se extrae el ADN del microorganismo a identificar y se expone a unas sondas moleculares específicas de unas especies concretas. La fijación de la sonda al ADN permite confirmar la identidad del
microorganismo. Esta técnica también se ha utilizado para la identificación directa de microorganismos en muestras clínicas, lo cual evita la necesidad de cultivarlos. La hibridización del ADN también constituye una valiosa herramienta diagnóstica
para la rápida detección e identificación de microorganismos de crecimiento lento, como micobacterias y hongos. Una ampliación del método de hibridación es el llamado análisis de secuencias de ácidos nucleicos. Se utilizan sondas para localizar unas secuencias específicas en los ácidos nucleicos que son características de un género, especie o subespecie determinado. Estas secuencias se amplifican hasta producir millones de copias, tras lo cual se secuencia el material genético amplificado con el propósito de definir la identidad exacta de la cepa. La aplicación más frecuente de este método es el análisis de secuencias de ADN ribosómico, puesto que existen tanto secuencias de ADN muy conservadas (específicas de familia o de género) como secuencias muy variables (específicas de especie o de subespecie). Esta técnica también se ha empleado para definir la relación evolutiva existente entre distintos microorganismos, así como para identificar microorganismos de crecimiento difícil o imposible. La mayor parte de los cambios recientes introducidos en la nomenclatura
taxonómica se han relacionado con la aplicación del análisis de secuencias de ácidos nucleicos. Una ampliación de este método es la secuenciación del genoma completo de una bacteria, la cual es ya posible desde el punto de vista técnico, aunque aún no se haya utilizado con fines diagnósticos. Otros métodos utilizados fundamentalmente para clasificar los microorganismos a nivel de subespecie y con fines epidemiológicos
son el análisis de plásmidos, el ribotipado y el análisis de fragmentos del ADN cromosómico. A lo largo de los últimos años se han simplificado los aspectos técnicos
de todos estos métodos hasta lograr que la mayor parte de los laboratorios clínicos utilicen diferentes variaciones en su práctica habitual.





Morfología, Síntesis y Estructura de la Pared Celular de las Bacterias.

Diferencias entre los eucariotas y los procariotas
Las células de los animales, las plantas y los hongos son eucariotas (del griego, «núcleo verdadero»), mientras que las de las bacterias y las cianobacterias son procariotas (del griego, «núcleo primitivo»). Además de carecer de un núcleo
y de otros orgánulos, los procariotas poseen un ribosoma más pequeño (el ribosoma 70S); asimismo, la mayoría de las bacterias poseen una pared celular de peptidoglucano cuya estructura es semejante a una malla que rodea a las membranas para protegerlas del entorno. Las bacterias son capaces de sobrevivir (y, en ciertos casos, incluso de proliferar) en el seno de unos ambientes hostiles en los que la presión osmótica extracelular es tan baja que provocaría la lisis de la mayoría
de las células eucariotas, o bien en presencia de temperaturas extremas (tanto de frío como de calor), en un ambiente seco y con fuentes de energía diversas y exiguas.

Diferencias entre los procariotas
Las bacterias pueden distinguirse entre sí por su morfología (tamaño, forma y características de tinción) y sus propiedades metabólicas, antigénicas y genéticas. Aunque es difícil diferenciar a las bacterias en función de su tamaño, estas presentan
formas diferentes. De este modo, una bacteria esférica (p. ej., Staphylococcus) es un coco; una bacteria en forma de bastoncillo (p. ej., Escherichia coli) es un bacilo, y Treponema, que tiene forma helicoidal, es un espirilo. Asimismo, las especies de Nocardía y Actinomyces poseen unos filamentos ramificados semejantes a los que se observan en los hongos. Algunas bacterias forman agregados, como los cúmulos arracimados de Staphylococcus aureus o el diplococo (dos células juntas) habitual
en las especies de los géneros Streptococcus y Neisseria.

Bacilos Acidos Alcohol Resistentes
( Tincion Ziehl-Neelsen )


Ácido-alcohol resistencia es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración, que se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados según la tinción de Gram, la cual es la técnica más común en la microbiología contemporánea, sin embargo puede ser teñido con algunas tinciones concentradas combinadas con calor. Una vez teñida tiene la capacidad de resistir la decoloración de una combinación de alcohol- ácido, el cual es el decolorante más común en los protocolos de tinción de bacterias, de donde viene el nombre Alcohol-ácido resistente.

Las micobacterias ( Mycobacterium ) como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.


Es una técnica de tinción diferencial, donde la bacteria queda teñida en rojo y se agrega una tinción de contraste de nombre azul de metileno la cual permite apreciar de mejor forma la bacteria. La tinción fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 -1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854-1894), un patólogo.


Microorganismos Acido-Alcohol Resistentes


Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistentes


Parásitos coccídeos (Cryptosporidium...) de muestras fecales.


Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistentes.




Generos de Bacilos Acidos Alcohol Resistentes


Mycobacterium

1-. Aerobia estricta, inmovil y no esporulado.
2-. Patogeno estricto = tuberculosis
3-. Adquirida por inhalación
4-. Inhibicion de la fusion del fagolisosoma para no ser fagocitado
5-. La pared celular es rica en lipidos rifampicina.

La estructrura de la pared celular micobacteriana consta de membrana plasmica, peptidoglucano, arabinogalactano, lipoarabinomanano con cabeza de mañosa, proteinas asociadas a la membrana plasmatica y a la pared celular.

Mycobactrium tuberculosis


1-. Reino : bacteria


2-. Filo: actinobacteria


3-. Familia mycobacteriacea


4-. Genero: mycobacterium


5-. Especie: m. tuberculosis





Ingresa en las vias respitarorias y las diminutas particulas infecciosas alcanzan los alveolos, y son digeridas por los macrofagos alveolares, necesita de 3 a 8 semanas de incubacion.



Caracteristicas : tuberculosis : pulmonar, extra pulmonar.


Caracteristicas epidemiologica: personas de cualquier edad con vih: los pacientes infectados presentan el mayor riesgo de padecer la enfermedad activa.


Factores de sobreviviencia : capacidad de sobrevivir y multiplicarse en el interior de los macrofagos .


Tratramiento : politerapia con isoniazida, etambutol y piracinamida.


Mycobacterium leprae
1-. Reino bacteria
2-. Filo: actinobacteria
3-. Orden: actinomycetales
4-. Familia: mycobacteriaceae
5-. Genero: mycobacterium
6-. Especie: m. leprae



Caracteristicas clinicas : lepra: desde forma tuberculoide hasta forma lepromatosa.
Caracteristicas epidemiologica: el contacto con un sujeto infectado constituye el mecanismo mas probable de diseminación.
Factores de virulencia :capacidad de sobrevivir y multiplicarse en el interior de los macrofagos .
Tratamiento : dapsona y rifampicina a la forma tuberculoide; se añade clofacimina frente a la forma lepromatosa.



Micobacterias que existen actualmente:
M. abscessus, que es también un contaminante común del agua y fue hasta hace poco considerado como una subespcie de M. chelonae.
M. africanum
M. asiaticum
Mycobacterium avium complex (MAC), que es un complejo causante de infecciones letales en pacientes con SIDA. Incluye: M. avium, M. avium paratuberculosis, que ha sido implicado en la enfermedad de Crohn en humanos y la enfermedad de Johne en ovejas, M. avium silvaticum, M. avium "hominissuis"
M. bovis
M. chelonae, contaminante común del agua.
M. fortuitum
M. gordonae
M. haemophilum
M. kansasii, que puede causar infección grave en pacientes inmunodeprimidos.
M. leprae, que causa la lepra.
M. lepromatosis, que causa la lepra lepromatosa difusa o DLL.
M. malmoense
M. marinum
M. microti
M. monacense
M. scrofulaceum
M. smegmatis
Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), cuyos miembros causan la tuberculosis en humanos y animales. Incluye las especies: M. tuberculosis, la principal causa de la tuberculosis en humanos, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti, etc
M. ulcerans, que causa la úlcera de Buruli.
M. xenopi
Las mas importantes actualmente son:
1-. Mycobacterium Tuberculosis
2-. Mycobacterium Leprae


Nocardia
1-. Reino: actinobacteria
2-. Orden: actinomycetales
3-. Familia: nocardiaceae
4-. Genero: nocardia

Nocardia es un género de bacterias Gram-positivas que se encuentran en suelos de todo el mundo ricos en materia orgánica. Son catalasa-positivas y con forma de bacilos filamentosos, parecen hilos alargados. Algunas especies son patogénicas causando nocardiosis.

Cultivo: Las colonias de Nocardia presentan un aspecto variable, particularmente cuando crecen en un medio con nutrientes limitados. Crecen lentamente sobre medios de cultivo no selectivo y son extrictamente aerobios con la facultad de crecer en un amplio rango de temperaturas. Algunas especies son parcialmente ácido-rápidas (en el sentido de que se necesita utilizar una solución menos concentrada de ácido sulfúrico o clorhídrico durante el procedimiento de tinción) debido a la presencia de ácidos micólicos de longitud intermedia en su pared celular.
Caracteristicas clinicas: trastornos broncopulmonares; infecciones cutaneas primarias o secundarias; abscesos cerebrales
Caracteristicas epidemiologica : patogeno oportunista en pacientes inmunodeprimidos con enfermedad pulmoral o cronica o pacientes inmunodeprimidos con deficiencias con linfocitos t
Factores de sobrevivencia : capacidad de sobrevivir y replicarse en el entorno intracelular y catalasa y superoxido de dismutasa.
Tratamiento: sulfonamidas; amikacina, cabapenemicos, o cefalosporinas de amplio espectro como tratramiento o alternativo si es sensible.

Técnica de Tincion

Hay dos variantes de esta técnica, la llamada "en caliente" y "en frío" o de Kinyoun y se siguen los siguientes pasos

1-. Variante clasica o en " caliente ".

Hacer un frotis de la muestra de esputo.

La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.

Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba. Coloque todos los portaobjetos orientados uniformemente, con el frotis hacia arriba. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez.

Dejar el frotis sobre el puente de tinción.

. Aplicar fucsina-fenicada.

Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período.

Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).

Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.

Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.

. Decolorar con alcohol-ácido.

Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 3 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.

. Aplicar azul de metileno (1 minuto).

Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto.

Enjuagar con agua

Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.

Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la observación al microscopio con 10 x 100

2-. Variante de Kiyoun o en " frio "-



  1. Hacer un frotis.

  2. Dejarlo en el puente de tinción.

  3. Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina).

  4. Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.

  5. Decolorar con alcohol acido.

  6. Lavar con agua del grifo.

  7. Contrastar con azul de metileno
TINCION GRAM

Introduccion:
En este tema veremos como la tincion gram nos ayuda para la identificación de bacterias – ya sean gram ( + ) o negativas ( - ) que es utlizado en microbiologia, que hace referencia a la morfologia celular bacteriana y que es empleado universalmente.

Tincion Gram
La tincion gram o coloracion gram es un tipo de tincion diferenc ia empliado en microbiologia y muy importante en laboratorios clinisco para la visualizacion de bacterias, sobre todo en muestras clinicas, debe su nombre al bacteriologo danes Christian Gram, que desarrollo la tecnica en 1884. El cual el estudiante debe de familiarizarse perfectamente para la identifiacion de bacterias. Las cuales pueden ser Gram ( + ) o Gram ( - ) dependiendo de su pared celular bacteriana. La tincion se utliza tanto para poder referirse a la morfologia y taxonomia bacteriana para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación; considerandose bacteria Gram ( + ) a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria Gram ( - ) a las que se visulizan de color rosa dependiendo de la pared celular de las diferentes bacterias.

Procedimiento para la Tincion Gram
El primer paso en cualquier tincion siempre tiene que ser la fijación por calor, esto es para eliminar microorganismos patogenos y no se formen nuevas degeneraciones posmortem.
Se pueden fijar por ebullucion pero generalmente se recurren al empleo de sustacion quimicas que penetran en su interior y coagulan sus componentes.
La solucion mas empleada es el formaldehído al 4%; tambien se pueden emplear sustancion como el HgCl2 y KCl2 .
El metodo es la extencion en un portaobjetos bien limpio; se coloca una gora de H2O2 a la que con el asa de siembra previamente esterilizada a la llama se lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o en su caso de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el portaobjetos y se fija la extencion por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.
Esta tincion emplea dos colorantes basicos: * cristal violeta ( usado como colorante primario ) y posteriormente * safranina ( empleado como colorante secundario o colorante de contraste Posteriormente con el cristal violeta ( colorante cationico ) penetran en todas las celulas bacterianas ( tanto Gram ( + ) como Gram ( - ). +

Coloracion
a-. 1 minuto de cristal violeta de Hucker ( colorante inicial )
b-. se lava con H2O2 .
c-. 1 minuto de lugol ( mordiente )
d-. se decolora con alcohol 95 ( decolorante )
e-. se lava con H2O2
f-. 1 minuto de fucsina Basica ( colorante de contraste ).
g-. se lava con agua corriente
h-. se seca suavemente o en su caso al aire libre.

5 comentarios:

  1. porque no ponen para que sirven los laboratorio quimicos-biologicos...eso es lo que io quiero saber..!!

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  2. porque los maestros piden investigar sobre esto si no hay nada en concreto

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  3. hay una persona que conozco Gaston Mierczewcky trabaja como quimico en la planta de CICAN COCACOLA MONTE GRANDE y no es quimico el boludo apenas termino el secundario ....asi esta el pais.

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  4. nesesito saber que son los laboratorios Quimico-Biologicos no todo el choro que m estan poniendo aqui¡¡¡
    porfavor

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  5. SIRVEN PARA CONFIRMAR EL DIAGNOSTICO DEL MEDICO NOSOTROS LOS QUIMICOS BIOLOGICOS , CLINICOS FORMAMOS PARTE DEL EQUIPO PARAMEDICO AUXILIARES EN EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO MEDICO.

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