NORMA:

ISO 17025

Gestión de Requisitos y Requisitos técnicos. Requisitos de gestión se relacionan principalmente con el funcionamiento y la eficacia del sistema de gestión de calidad dentro del laboratorio. Requisitos técnicos dirección de la competencia del personal, la metodología y prueba de equipos de calibración.
Los laboratorios utilizan la norma ISO / IEC 17025 para implementar un sistema de calidad destinado a mejorar su capacidad de producir constantemente los resultados válidos . Es también la base para la acreditación de un organismo de acreditación. Dado que la norma es de competencia, la acreditación es el reconocimiento formal de una simple demostración de que la competencia.

Industria alimentaria

La industria alimentaria es la parte de la industria encargada de la elaboración, transformación, preparación, conservación y envasado de los alimentos de consumo humano y animal. Las materias primas de esta industria se centra en los productos de origen vegetal (agricultura), animal (ganadería) y fungico, principalmente. El progreso de esta industria nos ha afectado en la actualidad de alimentación cotidiana, aumentando el número de posibles alimentos disponibles en la dieta. El aumento de producción ha ido unido con un esfuerzo progresivo en la vigilancia de la higiene y de las leyes alimentarias de los países intentando regular y unificar los procesos y los productos.

Sectores de la industria

Generalmente la industria alimentaria se ha considerado como un conjunto de industrias que consiste en:

Industria cárnica
Industria pesquera y de transformación de pescado
Conservas de frutas y hortalizasGrasas y aceites
Industria láctea
Productos molineríaProductos Alimentación Animal
Pan, pastelería y galletas
Azúcar
Cacao y chocolate
Vinos
Cerveza y malta
Otras bebidas alcohólicas
Aguas y bebidas analcohólicas
Otros productos diversos

INDUSTRIA ALIMENTICIA

Conozca si su alimento cumple o no con los parámetros establecidos por la Normativa vigente y de esta manera identifique y evite posibles riesgos derivados de una incorrecta manipulación de los alimentos. Una vez realizado el análisis alimentario, emitimos un informe calificando a los alimentos como "APTOS" o "NO APTOS" de acuerdo a los límites aceptables para cada tipo de alimento conforme a los criterios oficiales establecidos. RELACIÓN DE PRODUCTOS Y MÉTODOS EMPLEADOS EN LOS ANALISIS DE ALIMENTOS
Alimentos
FÍSICO-QUÍMICO
Parámetro	Método	Norma o bibliografía
Acidez	Especifico	MOA pg. 428
Ácido glutámico	Enzimático	Kit
Almidón	Enzimático	Kit
Azucares reductores	Vol. Redox	MOA pg. 530
Cenizas	Calcinación y pesada	MOA pg. 414
Cenizas insolubles en clorhídrico	Calcinación, digestión y pesada	MOA pg.545
Cloruros	Vohlard	MOA pg.443
Digestión húmeda	Digestión ácida oxidante	DSyP pg. 300
Digestión seca	Calcinación y mineralización	MOA PG.18
Fibra bruta	Digestiones, filtración y pesada	MOA pg.439
Fósforo total	Absorción UV/VIS	MOA pg. 21
Grasa	Extracción y pesada	-----
Humedad	Desecación y pesada	-----
Índice de refracción	Refractometria	MOA pg.330
º Brix	Refractometria	MOA pg.330
Proteínas	Nit. Kjeldhal x factor	MOA pg. 19
Sulfuroso libre	Vol. Redox (Yodo)	DOCE pg. 125
Viscosidad	Viscosímetro	-----

MICROBIOLÓGICOS
Parámetro	Método	Norma o bibliografía
Aerobios mesofilos revivificables	PCA	------
Anaerobias	SCHAEDLER	------
Bacillus cereus	MMOSSEL	------
Cloctridium perfringens	SPS 44 ºC	------
Clostridium sulfito-reductores	SPS	------
Enterobacterias totales	VRBG	------
Enterobacterias lactosa-positivas	VRBA	------
Escherichia coli	LEVINE	------
Estafilococo aureus	------	------
Levaduras	SABORAUD	------
Mohos	SABORAUD	------
Mohos y Levaduras	SABORAUD	------
Pseudomonas	------	MOA
Salmonella	------	MOA
Salmonella- Shigella	------	MOA
Shigella	------	MOA

UN BREVE RESUMEN DE UN ANÁLISIS QUÍMICO

Análisis químico, conjunto de técnicas y procedimientos empleados para identificar y cuantificar la composición química de una sustancia. En un análisis

cualitativo se pretende identificar las sustancias de una muestra. En el análisiscuantitativo lo que se busca es determinar la cantidad o concentración en que se encuentra una sustancia específica en

una muestra. Por ejemplo, averiguar si una muestra de sal contiene el elemento yodo sería un análisis cualitativo, y medir el porcentaje en masa de yodo de esa muestra constituiría un análisis cuantitativo.

Un análisis efectivo de una muestra suele basarse en una reacción química del componente, que produce una cualidad fácilmente identificable, como color, calor o insolubilidad. Los análisis gravimétricos basados en la medición de la masa de precipitados del componente, y los análisis volumétricos, que dependen de la medición de volúmenes de disoluciones que reaccionan con el componente, se conocen como ‘métodos por vía húmeda’, y resultan más laboriosos y menos versátiles que los métodos más modernos.

Los métodos instrumentales de análisis basados en instrumentos electrónicos cobraron gran importancia en la década de 1950, y hoy la mayoría de las técnicas analíticas se apoyan en estos equipos.

La determinación de la composición química de una sustancia es fundamental en el comercio, en las legislaciones y en muchos campos de la ciencia. Por ello, el análisis químico se diversifica en numerosas formas especializadas.

FUENTE:

http://mx.encarta.msn.com/encnet/refpages/RefArticle.aspx?refid=761579049

DESCRIPCION DE PERSONAL

DIRECTOR: L.Q. DAVID DUEÑAS MAT. 07402800400605

SUBDIRECTOR: L.Q. DANIEL SANTANA MORALES

QUIMICOS ENCARGADOS DE LAS SIGUIENTES AREAS:

INDUSTRIA AGRICOLA:

L.Q.J.MANUEL ARREOLA GARCIA

INDUSTRIA ALIMENTICIA:

L.Q.DANIEL SANTANA MORALES

L.Q.JORGE VEGA GARCIA

LABORATORIO QUIMICO-BIOLOGICO Y CLINICO:

L.Q.DAVID DUEÑAS

ESPECIALIDAD EN BACTERIOLOGIA, MICOLOGIA Y PARASITOLOGIA.

ENCARGADO DE ANALISIS DE PRODUCTOS PRE-TERMINADOS QUIMICO-BIOLOGICO.

LABORATORIO QUIMICO-BIOLOGICO Y CLINICO

BACTERIOLOGIA

Bacterias

Las bacterias poseen una estructura relativamente simple. Son microorganismos procariotas, es decir, unos microorganismos unicelulares sencillos, sin membrana nuclear, mitocondrias, aparato de Golgi ni retículo endoplásmico que se reproducen por división asexual. La pared celular que rodea a las bacterias es compleja, y existen dos formas básicas: una pared celular grampositiva con una gruesa capa de peptidoglucano y una pared celular gramnegativa con una delgada capa de peptidoglucano, así como una membrana externa. Algunas bacterias carecen de pared celular y compensan su ausencia sobreviviendo tan sólo en el interior de células del organismo anfitrión o en un ambiente hipertónico.

Para realizar una clasificación preliminar de las bacterias se utiliza su tamaño (de 1 a 20 Jim o más), forma (esferas, bastoncillos, espirales) y disposición espacial (células aisladas, en cadenas y formando cúmulos); mientras que su clasificación definitiva se refiere a sus propiedades fenotípicas y genotípicas. El organismo humano está habitado por miles de especies bacterianas distintas; mientras algunas mantienen una relación parasitaria temporal, otras habitan en el ser humano de manera permanente. También se encuentran bacterias en el ambiente, como el aire que se respira, el agua que se bebe y los alimentos que se comen; aunque muchas de ellas son relativamente avirulentas, otras son capaces de provocar enfermedades potencialmente mortales. La enfermedad puede deberse a los efectos tóxicos de los productos bacterianos (toxinas) o bien a la invasión de regiones corporales que acostumbran a ser estériles.

Clasificacion de las Bacterias

Clasificacion Fenotipica
Las morfologías microscópica y macroscópica de las bacterias fueron las primeras características utilizadas para identificarlas y aún constituyen unos elementos fundamentales en la mayoría de los algoritmos de identificación utilizados actualmente. Además, el aspecto macroscópico de las colonias bacterianas (p. ej., las propiedades hemolíticas en un medio de agar sangre, la pigmentación, el tamaño y la forma de las colonias y el olor de las colonias) también se emplea en la identificación
de las bacterias. Las características morfológicas se utilizan para realizar una identificación provisional del microorganismo y poder seleccionar otros métodos de clasificación con un mayor poder de discriminación, ya que muchos microorganismos pueden presentar un aspecto muy similar en el examen macro y microscópico. Los métodos más frecuentes y que todavía se utilizan en la identificación de las bacterias consisten en determinar la presencia o la ausencia de unos marcadores bioquímicos específicos (p. ej., capacidad de fermentación de hidratos de carbono específicos o la utilización de diferentes compuestos como fuente de carbono para poder proliferar; presencia de proteasas, lipasas o nucleasas específicas; o presencia de enzimas hidrolíticas específicas como lipasas y nucleasas). El empleo de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar con un alto grado de precisión la mayoría de las cepas clínicamente significativas. Además, estos métodos se han empleado para subdividir los grupos de microorganismos más allá del nivel de especie, principalmente con fines epidemiológicos (p. ej., para determinar si un grupo de microorganismos pertenecientes al mismo género y especie comparten un origen común o bien proceden de fuentes distintas). Estas técnicas son conocidas como determinación del biotipo o biotipado. ísticos, los anticuerpos utilizados para su detección constituyen
una potente herramienta diagnóstica (serotipado). Estas pruebas serológicas se realizan con el fin de identificar microorganismos que son inertes frente a las pruebas bioquímicas (p. ej., Francisella, el microorganismo causante de la tularemia), cuyo cultivo es difícil o imposible (p. ej., Treponema pallidum, el microorganismo responsable de la sífilis), asociados a síndromes específicos o deben identificarse de forma rápida (p. ej., S. pyogenes, responsable de la faringitis estreptocócica). Por otra parte, la determinación de los serotipos se emplea también con fines epidemiológicos. Otros ejemplos de los métodos fenotípicos utilizados en la clasificación de las bacterias son el estudio de los patrones de sensibilidad del microorganismo frente a distintos antibióticos (antibiograma) y el lisotipado (susceptibilidad a determinados virus que infectan a las bacterias). Las técnicas de susceptibilidad a los antibióticos tienen un menor poder de discriminación. El lisotipado es una técnica engorrosa, por lo que actualmente ha sido sustituida por técnicas genéticas con mayor sensibilidad.

Clasificacion Analitica
Las características analíticas de las bacterias se han utilizado también para clasificarlas en géneros, especies y subespecies. El patrón cromatográfico de los ácidos micólicos de la pared celular es característico de un gran número de especies de micobacterias, por lo que durante muchos años se ha utilizado en la identificación de las especies aisladas con mayor frecuencia. El análisis de los lípidos presentes en la totalidad de la célula también es un método útil para la descripción de numerosas especies bacterianas y de levaduras. Otras técnicas empleadas para la caracterización, fundamentalmente a nivel de subespecie y con fines epidemiológicos, son el análisis de las proteínas celulares (análisis proteómico mediante espectroscopia de masas) y las enzimas celulares (electroforesis enzimática tipo multiloci). Sin embargo, y pese a que estos métodos analíticos son precisos y reproducibles, requieren un gran trabajo y una instrumentación muy cara. Por tal motivo, estos análisis se emplean principalmente en los laboratorios de referencia.

Clasificacion Genotipica
El método más preciso de clasificación de las bacterias es el análisis de su material genético. Aunque inicialmente los microorganismos se clasificaron según la relación
guanina/citosina, este procedimiento se ha abandonado en gran medida a favor de otros métodos con mayor poder de discriminación. Aunque la hibridación del ADN (ácido desoxirribonucleico) se utilizó en un principio para establecer la relación existente entre las cepas bacterianas (es decir, para determinar si dos cepas pertenecían al mismo género o especie), más recientemente esta técnica se ha empleado para conseguir una rápida identificación de los microorganismos
mediante el uso de sondas moleculares. Se extrae el ADN del microorganismo a identificar y se expone a unas sondas moleculares específicas de unas especies concretas. La fijación de la sonda al ADN permite confirmar la identidad del
microorganismo. Esta técnica también se ha utilizado para la identificación directa de microorganismos en muestras clínicas, lo cual evita la necesidad de cultivarlos. La hibridización del ADN también constituye una valiosa herramienta diagnóstica
para la rápida detección e identificación de microorganismos de crecimiento lento, como micobacterias y hongos. Una ampliación del método de hibridación es el llamado análisis de secuencias de ácidos nucleicos. Se utilizan sondas para localizar unas secuencias específicas en los ácidos nucleicos que son características de un género, especie o subespecie determinado. Estas secuencias se amplifican hasta producir millones de copias, tras lo cual se secuencia el material genético amplificado con el propósito de definir la identidad exacta de la cepa. La aplicación más frecuente de este método es el análisis de secuencias de ADN ribosómico, puesto que existen tanto secuencias de ADN muy conservadas (específicas de familia o de género) como secuencias muy variables (específicas de especie o de subespecie). Esta técnica también se ha empleado para definir la relación evolutiva existente entre distintos microorganismos, así como para identificar microorganismos de crecimiento difícil o imposible. La mayor parte de los cambios recientes introducidos en la nomenclatura
taxonómica se han relacionado con la aplicación del análisis de secuencias de ácidos nucleicos. Una ampliación de este método es la secuenciación del genoma completo de una bacteria, la cual es ya posible desde el punto de vista técnico, aunque aún no se haya utilizado con fines diagnósticos. Otros métodos utilizados fundamentalmente para clasificar los microorganismos a nivel de subespecie y con fines epidemiológicos
son el análisis de plásmidos, el ribotipado y el análisis de fragmentos del ADN cromosómico. A lo largo de los últimos años se han simplificado los aspectos técnicos
de todos estos métodos hasta lograr que la mayor parte de los laboratorios clínicos utilicen diferentes variaciones en su práctica habitual.

Morfología, Síntesis y Estructura de la Pared Celular de las Bacterias.

Diferencias entre los eucariotas y los procariotas
Las células de los animales, las plantas y los hongos son eucariotas (del griego, «núcleo verdadero»), mientras que las de las bacterias y las cianobacterias son procariotas (del griego, «núcleo primitivo»). Además de carecer de un núcleo
y de otros orgánulos, los procariotas poseen un ribosoma más pequeño (el ribosoma 70S); asimismo, la mayoría de las bacterias poseen una pared celular de peptidoglucano cuya estructura es semejante a una malla que rodea a las membranas para protegerlas del entorno. Las bacterias son capaces de sobrevivir (y, en ciertos casos, incluso de proliferar) en el seno de unos ambientes hostiles en los que la presión osmótica extracelular es tan baja que provocaría la lisis de la mayoría
de las células eucariotas, o bien en presencia de temperaturas extremas (tanto de frío como de calor), en un ambiente seco y con fuentes de energía diversas y exiguas.

Diferencias entre los procariotas
Las bacterias pueden distinguirse entre sí por su morfología (tamaño, forma y características de tinción) y sus propiedades metabólicas, antigénicas y genéticas. Aunque es difícil diferenciar a las bacterias en función de su tamaño, estas presentan
formas diferentes. De este modo, una bacteria esférica (p. ej., Staphylococcus) es un coco; una bacteria en forma de bastoncillo (p. ej., Escherichia coli) es un bacilo, y Treponema, que tiene forma helicoidal, es un espirilo. Asimismo, las especies de Nocardía y Actinomyces poseen unos filamentos ramificados semejantes a los que se observan en los hongos. Algunas bacterias forman agregados, como los cúmulos arracimados de Staphylococcus aureus o el diplococo (dos células juntas) habitual
en las especies de los géneros Streptococcus y Neisseria.

Bacilos Acidos Alcohol Resistentes
( Tincion Ziehl-Neelsen )

Ácido-alcohol resistencia es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración, que se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados según la tinción de Gram, la cual es la técnica más común en la microbiología contemporánea, sin embargo puede ser teñido con algunas tinciones concentradas combinadas con calor. Una vez teñida tiene la capacidad de resistir la decoloración de una combinación de alcohol- ácido, el cual es el decolorante más común en los protocolos de tinción de bacterias, de donde viene el nombre Alcohol-ácido resistente.

Las micobacterias ( Mycobacterium ) como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.

Es una técnica de tinción diferencial, donde la bacteria queda teñida en rojo y se agrega una tinción de contraste de nombre azul de metileno la cual permite apreciar de mejor forma la bacteria. La tinción fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 -1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854-1894), un patólogo.

Microorganismos Acido-Alcohol Resistentes

Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistentes

Parásitos coccídeos (Cryptosporidium...) de muestras fecales.

Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistentes.




Generos de Bacilos Acidos Alcohol Resistentes


Mycobacterium

1-. Aerobia estricta, inmovil y no esporulado.
2-. Patogeno estricto = tuberculosis
3-. Adquirida por inhalación
4-. Inhibicion de la fusion del fagolisosoma para no ser fagocitado
5-. La pared celular es rica en lipidos rifampicina.

La estructrura de la pared celular micobacteriana consta de membrana plasmica, peptidoglucano, arabinogalactano, lipoarabinomanano con cabeza de mañosa, proteinas asociadas a la membrana plasmatica y a la pared celular.

Mycobactrium tuberculosis

1-. Reino : bacteria

2-. Filo: actinobacteria

3-. Familia mycobacteriacea

4-. Genero: mycobacterium

5-. Especie: m. tuberculosis

Ingresa en las vias respitarorias y las diminutas particulas infecciosas alcanzan los alveolos, y son digeridas por los macrofagos alveolares, necesita de 3 a 8 semanas de incubacion.

Caracteristicas : tuberculosis : pulmonar, extra pulmonar.

Caracteristicas epidemiologica: personas de cualquier edad con vih: los pacientes infectados presentan el mayor riesgo de padecer la enfermedad activa.

Factores de sobreviviencia : capacidad de sobrevivir y multiplicarse en el interior de los macrofagos .

Tratramiento : politerapia con isoniazida, etambutol y piracinamida.

Mycobacterium leprae
1-. Reino bacteria
2-. Filo: actinobacteria
3-. Orden: actinomycetales
4-. Familia: mycobacteriaceae
5-. Genero: mycobacterium
6-. Especie: m. leprae



Caracteristicas clinicas : lepra: desde forma tuberculoide hasta forma lepromatosa.
Caracteristicas epidemiologica: el contacto con un sujeto infectado constituye el mecanismo mas probable de diseminación.
Factores de virulencia :capacidad de sobrevivir y multiplicarse en el interior de los macrofagos .
Tratamiento : dapsona y rifampicina a la forma tuberculoide; se añade clofacimina frente a la forma lepromatosa.

Micobacterias que existen actualmente:
M. abscessus, que es también un contaminante común del agua y fue hasta hace poco considerado como una subespcie de M. chelonae.
M. africanum
M. asiaticum
Mycobacterium avium complex (MAC), que es un complejo causante de infecciones letales en pacientes con SIDA. Incluye: M. avium, M. avium paratuberculosis, que ha sido implicado en la enfermedad de Crohn en humanos y la enfermedad de Johne en ovejas, M. avium silvaticum, M. avium "hominissuis"
M. bovis
M. chelonae, contaminante común del agua.
M. fortuitum
M. gordonae
M. haemophilum
M. kansasii, que puede causar infección grave en pacientes inmunodeprimidos.
M. leprae, que causa la lepra.
M. lepromatosis, que causa la lepra lepromatosa difusa o DLL.
M. malmoense
M. marinum
M. microti
M. monacense
M. scrofulaceum
M. smegmatis
Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), cuyos miembros causan la tuberculosis en humanos y animales. Incluye las especies: M. tuberculosis, la principal causa de la tuberculosis en humanos, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti, etc
M. ulcerans, que causa la úlcera de Buruli.
M. xenopi
Las mas importantes actualmente son:
1-. Mycobacterium Tuberculosis
2-. Mycobacterium Leprae

Nocardia
1-. Reino: actinobacteria
2-. Orden: actinomycetales
3-. Familia: nocardiaceae
4-. Genero: nocardia

Nocardia es un género de bacterias Gram-positivas que se encuentran en suelos de todo el mundo ricos en materia orgánica. Son catalasa-positivas y con forma de bacilos filamentosos, parecen hilos alargados. Algunas especies son patogénicas causando nocardiosis.

Cultivo: Las colonias de Nocardia presentan un aspecto variable, particularmente cuando crecen en un medio con nutrientes limitados. Crecen lentamente sobre medios de cultivo no selectivo y son extrictamente aerobios con la facultad de crecer en un amplio rango de temperaturas. Algunas especies son parcialmente ácido-rápidas (en el sentido de que se necesita utilizar una solución menos concentrada de ácido sulfúrico o clorhídrico durante el procedimiento de tinción) debido a la presencia de ácidos micólicos de longitud intermedia en su pared celular.
Caracteristicas clinicas: trastornos broncopulmonares; infecciones cutaneas primarias o secundarias; abscesos cerebrales
Caracteristicas epidemiologica : patogeno oportunista en pacientes inmunodeprimidos con enfermedad pulmoral o cronica o pacientes inmunodeprimidos con deficiencias con linfocitos t
Factores de sobrevivencia : capacidad de sobrevivir y replicarse en el entorno intracelular y catalasa y superoxido de dismutasa.
Tratamiento: sulfonamidas; amikacina, cabapenemicos, o cefalosporinas de amplio espectro como tratramiento o alternativo si es sensible.

Técnica de Tincion

Hay dos variantes de esta técnica, la llamada "en caliente" y "en frío" o de Kinyoun y se siguen los siguientes pasos

1-. Variante clasica o en " caliente ".

Hacer un frotis de la muestra de esputo.

La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.

Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba. Coloque todos los portaobjetos orientados uniformemente, con el frotis hacia arriba. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez.

Dejar el frotis sobre el puente de tinción.

. Aplicar fucsina-fenicada.

Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período.

Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).

Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.

Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.

. Decolorar con alcohol-ácido.

Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 3 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.

. Aplicar azul de metileno (1 minuto).

Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto.

Enjuagar con agua

Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.

Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la observación al microscopio con 10 x 100

2-. Variante de Kiyoun o en " frio "-

1. Hacer un frotis.


2. Dejarlo en el puente de tinción.


3. Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina).


4. Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.


5. Decolorar con alcohol acido.


6. Lavar con agua del grifo.


7. Contrastar con azul de metileno

TINCION GRAM

Introduccion:
En este tema veremos como la tincion gram nos ayuda para la identificación de bacterias – ya sean gram ( + ) o negativas ( - ) que es utlizado en microbiologia, que hace referencia a la morfologia celular bacteriana y que es empleado universalmente.

Tincion Gram
La tincion gram o coloracion gram es un tipo de tincion diferenc ia empliado en microbiologia y muy importante en laboratorios clinisco para la visualizacion de bacterias, sobre todo en muestras clinicas, debe su nombre al bacteriologo danes Christian Gram, que desarrollo la tecnica en 1884. El cual el estudiante debe de familiarizarse perfectamente para la identifiacion de bacterias. Las cuales pueden ser Gram ( + ) o Gram ( - ) dependiendo de su pared celular bacteriana. La tincion se utliza tanto para poder referirse a la morfologia y taxonomia bacteriana para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación; considerandose bacteria Gram ( + ) a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria Gram ( - ) a las que se visulizan de color rosa dependiendo de la pared celular de las diferentes bacterias.

Procedimiento para la Tincion Gram
El primer paso en cualquier tincion siempre tiene que ser la fijación por calor, esto es para eliminar microorganismos patogenos y no se formen nuevas degeneraciones posmortem.
Se pueden fijar por ebullucion pero generalmente se recurren al empleo de sustacion quimicas que penetran en su interior y coagulan sus componentes.
La solucion mas empleada es el formaldehído al 4%; tambien se pueden emplear sustancion como el HgCl₂ y KCl2 .
El metodo es la extencion en un portaobjetos bien limpio; se coloca una gora de H2O2 a la que con el asa de siembra previamente esterilizada a la llama se lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o en su caso de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el portaobjetos y se fija la extencion por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.
Esta tincion emplea dos colorantes basicos: * cristal violeta ( usado como colorante primario ) y posteriormente * safranina ( empleado como colorante secundario o colorante de contraste Posteriormente con el cristal violeta ( colorante cationico ) penetran en todas las celulas bacterianas ( tanto Gram ( + ) como Gram ( - ). +

Coloracion
a-. 1 minuto de cristal violeta de Hucker ( colorante inicial )
b-. se lava con H2O2 .
c-. 1 minuto de lugol ( mordiente )
d-. se decolora con alcohol 95 ( decolorante )
e-. se lava con H2O2
f-. 1 minuto de fucsina Basica ( colorante de contraste ).
g-. se lava con agua corriente
h-. se seca suavemente o en su caso al aire libre.

PRUEBAS BIOQUIMICAS

Introduccion

Con frecuencia la identidad de una especie requiere que se conozca de manera detallada su actividad bioquimica, porque otras caracteristicas no son suficientemente distintivas o diferenciales.

En el laboratorio disponemos de numerosas tecnicas para la caracterizacion bioquimica de una especie.

Ademas de los productos finales de los procesos metabolicos, tambien se necesita conocer con detalle como se producen estoy cambios, como ocurren paso a paso las reaccines quimicas, cuales enzimas intervienen , cuales son los productos intermediarios ademas de que se deben reconstruir las secuencias de las reacciones bioquimicas que tienen lugar dentro de la celula.

En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva especifica o sustrato y después de la incubacion del cultivo se examina para ver los cambios quimicos que hayan ocurrido.

Kligler Hierro Agar

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologia de alimentos para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa, y a la producción de acido sulfihidrico.

Formula de contenido ( en gramos por litro)

1-. Peptona de carne 6-. Citrato de hierro y amonio

2-. Cloruro de sodio 7-. Tiosulfato de sodio

3-. Lactosa 8-. Rojo de fenol.

4-. Tripteina 9-. Agar

5-. Glucosa

Instrucciones

Suspender 54.8 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos ensayo. Esterilizar a 121 grados centrigados por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Fundamento

• La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.
• El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de acido sulfhidrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el acido sulfhidrico y producen sulfuro de hierro, color negro.
• El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmotico. El agar es el agente solidificante.
  

Por fermentación de azucares, se producen acido, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio acido.

• El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrogeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tipico sulfuro de hierro de color negro.

Resultados

1. pico acalino/fondo acido ( pico rojo/fondo amarillo ): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.
2. pico acido/fondo acido ( pico amarillo/fondo amarillo ): el microorganismo fermenta glucosa y lactosa.
3. pico alcalino/.fondo alcalino ( pico rojo/fondo rojo ): el microorganismo esno fermentador de azucares.
4. la presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.
5. el ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce acido sulfhidrico.

Tsi Agar

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de acido sulfhidrico.

Formula de contenido ( en gramos por litro ).

1-. Extracto de carne 3.0 6-. Glucosa 1.0 9-.Rojo fenol

2-. Plutipeptona 20.0 7-. Sulfato de hierro

3-. Cloruro de sodio 5.0 y amonio. 0.2

4-. Lactosa 10.0 8-. Tiosulfato de

5-. Sacarosa 10.0 sodio.

Instrucciones

Suspender 62.5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121 grados centigrados por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Fundamento

• En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.
• La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables
• El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de acido sulfhidrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el acido sulfhidrico y producen sulfuro de hierroo, de color negro.
• El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmotico.
• Por fermentación de azucares, se producen acidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio acido.
• El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrogeno el que reacciona con una sal de hierro proporcionando el tipico sulfuro de hierro color negro.

Lisina Hierro Agar

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismo, especialmente Salmonella spp; basado en la decarboxilacion / desaminacion de lisina y en la producción de acido sulfhidrico.

Formula de contenido ( en gramos por litro ).

1-. Peptona de gelatina 5.0 6-. Tiosulfato de sodio 0.04

2-. Extracto de levadura 3.0 7-. Purpura de brocomocresol 0.02

3-. Glucosa 1.0 8-. Agar 15.0

4-. Lisina 10.0

5-. Citrato de hierro y

Amonio 0.5

Instrucciones

Suspender 35g del medio deshidratado en un litro de agua destilad. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucion completa. Distribuir y esterilizar a 121 grados centrigados durante15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncion.

Fundamento

• En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano.
• La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminas.
• El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de acido sulfhidrico.
  

• El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cul es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2 y de color violeta a pH iguall o mayor a 6.8.
• Por decarboxilacion de la lisina, se produce la amina cadavarina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.
• La decarboxilacion de la lisina, tiene lugar en medio acido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
• Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hrs de incubacion se observa el pico de color violeta debido al consumo de peptonas, y el fondo amarillo.
• La producción de sulfuro de hidrogeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación del sulfuro de hierro.
• Las cepas de los generos Proteus, Providecia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un acido alfa-ceto-carbonico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxigeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Resultados

1. Decarboxilacion de la lisina:

-Prueba positiva : pico violeta/fondo violeta.

-Prueba negatiba : pico violeta/fondo amarillo.

2-. Desaminacion de la lisina:

- Pico rojo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del genero

Proteus, providencia y alguna cepas de Morganella spp.

3-. Produccion de acido sulfhidrico:

-Prueba positiva: ennegrecimiento del medio ( especialmente en

el limite del pico y fondo ).

MIO Medio

Medio usado para la identificación de Enterobacteruaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.

Formula de contenido ( gramos por litro ).

1-. Dextrosa 1.0 6-. Agar 2.0

2-. Extracto de carne 3.0 7-. Púrpura

3-. Peptona 10.0 de cromosol 0.02

4-. Tripteina 10.0

5-. Clorhidrato de

L-ornitina 5.0

Instrucciones

Suspender 31g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta completar la disolución. Distribuir en tubos de ensayo y esterilizar a 121 grados centigrados por 15 minutos.

Fundamento

· Medio de cultivo semisolido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteina.

· Ademas, la tripteina aporta grandes cantidades de triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.

· La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccion de la enzima ornitina decarboxilasa, el purpura de bromocrosol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color purpura y en medio acido es amarillo.

· Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.

· La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas alla de la linea de inoculación.

· La reaccion positiva a la ornitina esta dada por un color purpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicion acida y originando que el indicador de pH purpura de brocomesol vire al amarillo.

· La presencia de acidez, otorga condiciones optimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.

· Por decarboxilacion, se alcalina el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color purpura.

· El indol, es producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac’s o de Erlich, indica un resultado positivo.

Resultados.

1-. Movilidad

-Resultado positivo: presencia de tubidez o crecimiento mas alla de la linea de siembra.

- Resultado negativo: crecimiento solamente en la linea de siembra.

2-. Ornitina decarboxilasa

- Resultado positivo: color purpura.

- Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violaceo en la superficie del medio.

3-. Prueba indol:

La prueba indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina .

- Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.

- Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

Caracteristicas del medio.

Medio preparado: purpura transparente a ligeramente opalescente.

SIM Medio

Es un medio semisolido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrogeno en un mismo tubo. Es util para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Formula de contenido (en gramos por litro )

1-. Tripteina 20.00

2-. Peptona 6.1

3-. Sulfato de hierro

y amonio. 0.2

4-. Tiosulfato de Na 0.2

5-. Agar 3.5

Instrucciones:

Suspender 30 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver, calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemolisis y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.

Fundamento.

El triptofano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteina, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol.

En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.

El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo.

Las cepas moviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncion de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhidrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2 .

Resultados.

Cepas moviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas alla de la linea de siembra.

Cepas inmoviles: el crecimiento se observa solamente en la linea de siembra.

Cepas SH₂, positivas: ennegrecimiento a lo largo de la linea de siembra o en todo el medio.

Cepas SH₂, negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac’s o de Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.

UREA

Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureasica. Es particularmente util para diferenciar Proteus spp: de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Formula de contenido ( en gramos por litro )

1-. Urea 20.0

2-. Fosfato monopotásico 9.1

3-. Fosfato disodico 9.5

4-. Extracto de levadura 0.1

5-. Rojo fenol 0.01

Instrucciones.

Suspender 3.87 g del medio deshidratado por cada 100 ml de agua destilada. Distribuir en tubos pequeños esteriles, entre 0.5 y 2 ml.

Fundamento.

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuar, presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer.

El extracto de lavadura es la unica fuente de carbono, nitrogeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que posean la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoniaco y dioxido de carbono. Estos productos metabolicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo de fenol al rojo. Su uso se recomienda para diferenciar Proteus spp de otros generos.

Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como unica fuente de carbono y energia.

Formula de contenido ( en gramos por litro )

1-. Citrato de sodio 2.0 6-. Azul de bromotimol 0.08

2-. Cloruro de sodio 5.0 7-. Agar 15.0

3-. Fosfato dipotasico 1.0

4-. Fosfato monoamónico 1.0

5-. Sulfato de Magnesio 0.2

Instrucciones

Suspender 24.2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos.

Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada.

Fundamento.

En el medio de cultivo, el fosfato de monoamónico es la unica fuente de nitrogeno y el citrato de sodio es la unica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano.

Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimatico.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmotico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como unica fuente de carbono, usan sales de amonio como unica fuente de nitrogeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeada, a traves del ciclo acido tricarboxilico. El desdoblamiento del citrato de progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ultimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a acidos organicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeada.

Resultados.

Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

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