PRUEBAS BIOQUIMICAS

Introduccion

Con frecuencia la identidad de una especie requiere que se conozca de manera detallada su actividad bioquimica, porque otras caracteristicas no son suficientemente distintivas o diferenciales.

En el laboratorio disponemos de numerosas tecnicas para la caracterizacion bioquimica de una especie.

Ademas de los productos finales de los procesos metabolicos, tambien se necesita conocer con detalle como se producen estoy cambios, como ocurren paso a paso las reaccines quimicas, cuales enzimas intervienen , cuales son los productos intermediarios ademas de que se deben reconstruir las secuencias de las reacciones bioquimicas que tienen lugar dentro de la celula.

En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva especifica o sustrato y después de la incubacion del cultivo se examina para ver los cambios quimicos que hayan ocurrido.

Kligler Hierro Agar

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologia de alimentos para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa, y a la producción de acido sulfihidrico.

Formula de contenido ( en gramos por litro)

1-. Peptona de carne 6-. Citrato de hierro y amonio

2-. Cloruro de sodio 7-. Tiosulfato de sodio

3-. Lactosa 8-. Rojo de fenol.

4-. Tripteina 9-. Agar

5-. Glucosa

Instrucciones

Suspender 54.8 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos ensayo. Esterilizar a 121 grados centrigados por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Fundamento

• La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.
• El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de acido sulfhidrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el acido sulfhidrico y producen sulfuro de hierro, color negro.
• El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmotico. El agar es el agente solidificante.
  

Por fermentación de azucares, se producen acido, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio acido.

• El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrogeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tipico sulfuro de hierro de color negro.

Resultados

1. pico acalino/fondo acido ( pico rojo/fondo amarillo ): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.
2. pico acido/fondo acido ( pico amarillo/fondo amarillo ): el microorganismo fermenta glucosa y lactosa.
3. pico alcalino/.fondo alcalino ( pico rojo/fondo rojo ): el microorganismo esno fermentador de azucares.
4. la presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.
5. el ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce acido sulfhidrico.

Tsi Agar

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de acido sulfhidrico.

Formula de contenido ( en gramos por litro ).

1-. Extracto de carne 3.0 6-. Glucosa 1.0 9-.Rojo fenol

2-. Plutipeptona 20.0 7-. Sulfato de hierro

3-. Cloruro de sodio 5.0 y amonio. 0.2

4-. Lactosa 10.0 8-. Tiosulfato de

5-. Sacarosa 10.0 sodio.

Instrucciones

Suspender 62.5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121 grados centigrados por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Fundamento

• En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.
• La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables
• El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de acido sulfhidrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el acido sulfhidrico y producen sulfuro de hierroo, de color negro.
• El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmotico.
• Por fermentación de azucares, se producen acidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio acido.
• El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrogeno el que reacciona con una sal de hierro proporcionando el tipico sulfuro de hierro color negro.

Lisina Hierro Agar

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismo, especialmente Salmonella spp; basado en la decarboxilacion / desaminacion de lisina y en la producción de acido sulfhidrico.

Formula de contenido ( en gramos por litro ).

1-. Peptona de gelatina 5.0 6-. Tiosulfato de sodio 0.04

2-. Extracto de levadura 3.0 7-. Purpura de brocomocresol 0.02

3-. Glucosa 1.0 8-. Agar 15.0

4-. Lisina 10.0

5-. Citrato de hierro y

Amonio 0.5

Instrucciones

Suspender 35g del medio deshidratado en un litro de agua destilad. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucion completa. Distribuir y esterilizar a 121 grados centrigados durante15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncion.

Fundamento

• En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano.
• La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminas.
• El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de acido sulfhidrico.
  

• El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cul es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2 y de color violeta a pH iguall o mayor a 6.8.
• Por decarboxilacion de la lisina, se produce la amina cadavarina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.
• La decarboxilacion de la lisina, tiene lugar en medio acido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
• Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hrs de incubacion se observa el pico de color violeta debido al consumo de peptonas, y el fondo amarillo.
• La producción de sulfuro de hidrogeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación del sulfuro de hierro.
• Las cepas de los generos Proteus, Providecia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un acido alfa-ceto-carbonico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxigeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Resultados

1. Decarboxilacion de la lisina:

-Prueba positiva : pico violeta/fondo violeta.

-Prueba negatiba : pico violeta/fondo amarillo.

2-. Desaminacion de la lisina:

- Pico rojo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del genero

Proteus, providencia y alguna cepas de Morganella spp.

3-. Produccion de acido sulfhidrico:

-Prueba positiva: ennegrecimiento del medio ( especialmente en

el limite del pico y fondo ).

MIO Medio

Medio usado para la identificación de Enterobacteruaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.

Formula de contenido ( gramos por litro ).

1-. Dextrosa 1.0 6-. Agar 2.0

2-. Extracto de carne 3.0 7-. Púrpura

3-. Peptona 10.0 de cromosol 0.02

4-. Tripteina 10.0

5-. Clorhidrato de

L-ornitina 5.0

Instrucciones

Suspender 31g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta completar la disolución. Distribuir en tubos de ensayo y esterilizar a 121 grados centigrados por 15 minutos.

Fundamento

· Medio de cultivo semisolido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteina.

· Ademas, la tripteina aporta grandes cantidades de triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.

· La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccion de la enzima ornitina decarboxilasa, el purpura de bromocrosol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color purpura y en medio acido es amarillo.

· Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.

· La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas alla de la linea de inoculación.

· La reaccion positiva a la ornitina esta dada por un color purpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicion acida y originando que el indicador de pH purpura de brocomesol vire al amarillo.

· La presencia de acidez, otorga condiciones optimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.

· Por decarboxilacion, se alcalina el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color purpura.

· El indol, es producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac’s o de Erlich, indica un resultado positivo.

Resultados.

1-. Movilidad

-Resultado positivo: presencia de tubidez o crecimiento mas alla de la linea de siembra.

- Resultado negativo: crecimiento solamente en la linea de siembra.

2-. Ornitina decarboxilasa

- Resultado positivo: color purpura.

- Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violaceo en la superficie del medio.

3-. Prueba indol:

La prueba indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina .

- Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.

- Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

Caracteristicas del medio.

Medio preparado: purpura transparente a ligeramente opalescente.

SIM Medio

Es un medio semisolido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrogeno en un mismo tubo. Es util para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Formula de contenido (en gramos por litro )

1-. Tripteina 20.00

2-. Peptona 6.1

3-. Sulfato de hierro

y amonio. 0.2

4-. Tiosulfato de Na 0.2

5-. Agar 3.5

Instrucciones:

Suspender 30 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver, calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemolisis y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.

Fundamento.

El triptofano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteina, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol.

En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.

El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo.

Las cepas moviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncion de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhidrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2 .

Resultados.

Cepas moviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas alla de la linea de siembra.

Cepas inmoviles: el crecimiento se observa solamente en la linea de siembra.

Cepas SH₂, positivas: ennegrecimiento a lo largo de la linea de siembra o en todo el medio.

Cepas SH₂, negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac’s o de Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.

UREA

Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad ureasica. Es particularmente util para diferenciar Proteus spp: de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Formula de contenido ( en gramos por litro )

1-. Urea 20.0

2-. Fosfato monopotásico 9.1

3-. Fosfato disodico 9.5

4-. Extracto de levadura 0.1

5-. Rojo fenol 0.01

Instrucciones.

Suspender 3.87 g del medio deshidratado por cada 100 ml de agua destilada. Distribuir en tubos pequeños esteriles, entre 0.5 y 2 ml.

Fundamento.

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuar, presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer.

El extracto de lavadura es la unica fuente de carbono, nitrogeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que posean la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoniaco y dioxido de carbono. Estos productos metabolicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo de fenol al rojo. Su uso se recomienda para diferenciar Proteus spp de otros generos.

Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como unica fuente de carbono y energia.

Formula de contenido ( en gramos por litro )

1-. Citrato de sodio 2.0 6-. Azul de bromotimol 0.08

2-. Cloruro de sodio 5.0 7-. Agar 15.0

3-. Fosfato dipotasico 1.0

4-. Fosfato monoamónico 1.0

5-. Sulfato de Magnesio 0.2

Instrucciones

Suspender 24.2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos.

Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada.

Fundamento.

En el medio de cultivo, el fosfato de monoamónico es la unica fuente de nitrogeno y el citrato de sodio es la unica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano.

Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimatico.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmotico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como unica fuente de carbono, usan sales de amonio como unica fuente de nitrogeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeada, a traves del ciclo acido tricarboxilico. El desdoblamiento del citrato de progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ultimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a acidos organicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeada.

Resultados.

Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

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